В июле 1946 года Комаров был переведен в Батайское военное училище имени А.К. Серова, окончив которое в 1949 году он поступил на службу военным летчиком-истребителем в авиационном полку истребительной авиационной дивизии ВВС Северо-Кавказского военного округа. 

За следующие 10 лет Комаров успел дослужиться до должности старшего летчика и отучиться на 1-м факультете Военно-воздушной академии имени Н.Е. Жуковского. После обучения он занялся испытаниями новых образцов авиационной техники в Государственном Красноказарменном НИИ ВВС. Там он и получил предложение заниматься испытательной работой в отряде космонавтов.

В апреле 1961 года Комаров завершил подготовку.

Первый полет состоялся 12 октября 1964 года. Вместе с еще двоими космонавтами, Константином Феоктистовым и Борисом Егоровым, он сутки провел в космосе на борту корабля «Восход».

За успешный полет Комаров получил звание Героя Советского Союза, орден Ленина и медаль «Золотая звезда». А в начале 1965 года он получил квалификацию космонавта третьего класса и был назначен инструктором-космонавтом в группу космонавтов, готовившихся по программам Министерства обороны.

Разработка нового корабля «Союз» началась еще в 1962 году. Она велась под руководством Сергея Королева. Первые три запуска были беспилотными и выявили серьезные недоработки в конструкции корабля: первый из них, «Космос-133», который предполагалось состыковать с другим кораблем, запущенным позже, израсходовал все топливо после отделения от ракеты-носителя, что сделало стыковку невозможной.

Посадить корабль тоже не удалось — при сборке была перепутана фазировка команд на управляющие рулевые сопла.

В итоге корабль был уничтожен с помощью системы автоматического подрыва — нельзя было допустить, чтобы он приземлился за пределами СССР.Второй «Союз» не успел даже подняться с Земли — на стартовом столе взорвалась ракета. У третьего корабля, «Космоса-140», возникли проблемы с автоматической системой ориентации, из-за этого он потратил слишком много топлива и не выполнил поставленные задачи. При посадке выяснилось, что теплозащита была нарушена при установке технологической заглушки, из-за чего у корабля прогорело дно. В итоге он вместо запланированного места посадки оказался над Аральским морем, пробил лед и пошел ко дну.

Но космическая гонка продолжалась. Несмотря на неудачи, четвертый запуск уже был пилотируемым.

Как рассказывала в одном из интервью дочь космонавта, майор Ирина Комарова, к 50-летию Октябрьской революции советская власть хотела свершений в космосе. Хотя часть конструкторов говорила о «сырости» корабля, занявший место умершего в 1966 году Королева Василий Мишин настоял на запуске. 

«Перед полетом отец зашел в больницу к знакомому летчику-испытателю, у которого обнаружили рак. Его жена потом рассказала маме о состоявшемся между ними разговоре. Отец признался в палате больному: «Процентов на девяносто полет будет неудачным», — говорила Ирина.

Дублером Комарова был назначен Юрий Гагарин. Если бы Комаров заболел, тот отправился бы в полет вместо него. На стартовую площадку их привезли вместе. Гагарин был последним, кто видел Комарова живым.

Спустя 540 секунд корабль отделился и вышел на орбиту искусственного спутника Земли. Проблемы начались сразу же — не смогла расправиться одна из панелей солнечной батареи. Она помешала открыться дублирующей антенне телеметрической системы и козырьку, защищающему солнечно-звездный датчик от выхлопов двигателей. Ни солнечная, ни звездная ориентация оказались невозможны. 

До десяти утра Госкомиссия определялась с дальнейшими действиями. В итоге было решено посадить корабль. К этому моменту Комаров совершал только пятый виток, сажать же планировалось на семнадцатом. Но посадка сорвалась — корабль вблизи экватора ушел по тангажу от ориентированного направления.

«Мы лихорадочно согласовываем с Госкомиссией вариант посадки на 18-м витке. Чувствуем, что не успеваем, — вспоминал потом в книге «Ракеты и люди» конструктор Борис Черток, один из соратников Королева. — Там, на другом конце линии ЗАС, снова идут споры.

Сеанс связи на 17-м витке закончился, а мы никаких новых указаний Комарову так и не успели передать.

Наконец выработан очевидно единственно возможный вариант. Он был в резерве, но теперь становится основным. Предлагаем ручную ориентацию на светлой стороне «по-самолетному», затем перед входом в тень передать управление гироскопам КИ-38. Это изделие фирмы Виктора Кузнецова нас еще никогда не подводило. После выхода из тени проверить и, если потребуется, подправить ориентацию вручную и выдать все положенные команды в расчетные времена для посадки на 19-м витке». 

Поначалу посадка шла нормально. По расчетам баллистиков, спускаемый аппарат должен был приземлиться в 6.24 в 65 км к востоку от Орска.

Черток писал: «Доклада с места посадки мы ни от кого не дождались. Госкомиссии теперь мы не нужны. Даже Гагарин не мог выяснить по сложной системе связи ВВС, как прошла посадка». Лишь через несколько часов Гагарин получил срочный вызов на связь. Ему сообщили, что приземление прошло ненормально, и велели срочно вылететь в Орск.

...Прибыв на место приземления спускаемого аппарата, поисковая группа увидела чудовищную картину. Сплющенный, на полметра вошедший в землю аппарат был объят пламенем, а вокруг суетились местные жители, пытаясь забросать огонь землей. Сбить пламя удалось только огнетушителями.

Причиной крушения оказался нераскрывшийся парашют. Основной не смог до конца выйти и раскрыться, а запасной запутался в его стропах.

По официальной версии комиссии, расследовавшей причины крушения, это произошло из-за резких перепадов давления: стакан с парашютом деформировался и защемил основной парашют.

Как отмечал Черток, одновременная работа основного и запасного парашютов ранее не изучалась. Версия комиссии казалась сомнительной. «Независимо от всех подкомиссий бригада специалистов нашего завода, оставшаяся на полигоне, решила провести свой эксперимент, — писал Черток. — У них были основания для сомнений. Они открыли люк ОСП, вытянули тормозной парашют, подцепили его стропы к подъемному крану через динамометр и начали подъем для замера усилия, при котором начнет выходить упаковка основного парашюта.

Каково же было удивление, когда оказалось, что массы СА в 2800 килограммов не хватало. А ведь при этом контейнер никакому перепаду давления и, следовательно, сдавливающей укладку парашюта деформации не подвергался. Об этом эксперименте они комиссии не доложили». 

На следующий после полета Комарова день был запланирован запуск «Союза-2» с тремя космонавтами на борту. Предполагалось, что двое из них через открытый космос переберутся в корабль Комарова, а затем оба корабля пойдут на посадку.

Если бы не проблемы с раскрытием батареи, второй запуск бы состоялся и погибли бы четверо космонавтов, а не один: конструкция обоих кораблей была идентична и ошибки в проектировании были допущены одинаковые.

Высказывалась и еще одна причина проблем с выходом парашюта. Технология производства космических кораблей подразумевала помещение спускаемого аппарата после обмазки теплозащитным покрытием в автоклав, где при высокой температуре происходила полимеризация синтетических смол, являющихся составной частью теплозащиты.

Но при изготовлении «Союзов» по срокам отстали крышки парашютных контейнеров, поэтому спускаемые аппараты были помещены в автоклав без них. И вполне вероятно, что летучие фракции обмазки осели на внутреннюю поверхность контейнеров, сделав ее липкой и шершавой, что и не дало выйти парашюту.

Рекомендации комиссии по повышению надежности включали полировку контейнеров, увеличение их объема, повышение жесткости. Самым важным итогом деятельности комиссии было решение о предварительной проверке всех ее рекомендаций при беспилотных пусках.

«Встряска, которую получила вся наша космическая промышленность, оказала решающее влияние на повышение надежности всех систем и дальнейшую программу отработки «Союзов», — писал Черток. — Все благополучно слетавшие, летающие и те, кто будут летать в космос на «Союзах», должны помнить, что надежным и благополучным возвращением на Землю они обязаны не только создателям космических кораблей, но и Владимиру Комарову».

Уже в 2000-х годах Черток говорил журналистам: «То, что случилось с Комаровым, — это наша ошибка, разработчиков систем. Мы пустили его слишком рано. Недоработали «Союз»... Гибель Комарова на совести конструкторов».

Сейчас «Союзы» стали ключевым компонентом советской и российской пилотируемых программ по освоению космоса, а после 2011 года — единственным средством доставки экипажей на Международную космическую станцию.

«У мамы от возмущения срывался голос: «Какое Щелково? Какие ожоги тела, если от тела ничего не осталось?»

Она показала это свидетельство Гагарину: «Юрочка, и кто мне поверит, что я вдова космонавта Комарова?» Гагарин побледнел, пошел «наверх» разбираться… Вскоре маме принесли другой документ, где уже значилось: «трагически погиб при завершении испытательного полета на космическом корабле «Союз-1», — вспоминала дочь. Семья космонавта в качестве компенсации получила квартиру в Москве и до развала СССР получала ежемесячные выплаты. Самого же Комарова посмертно наградили второй «Золотой звездой».

На месте гибели космонавта в июне 1967 года 13-я ракетная Оренбургская Красноказарменная дивизия установила обелиск в его честь. Сейчас там находится небольшой мемориальный парк. Обелиск спустя 20 лет был заменен на другой, увенчанный бюстом Комарова. Мемориальная табличка гласит: «Родина — отважному сыну летчику-космонавту СССР Владимиру Комарову на месте его гибели».